Los estudios de fase II sólo pueden comenzar una vez que se han completado todos los estudios de fase I. Los estudios de fase II son los llamados estudios terapéuticos exploratorios, que prueban el fármaco candidato en pacientes, es decir, en participantes que padecen la enfermedad para la que se está desarrollando el fármaco.

El número de participantes en esta fase varía de 100 a 500 y suelen seleccionarse según unos criterios de inclusión estrictos, lo que hace que la población del estudio sea bastante homogénea. Esto facilita la interpretación de los resultados del estudio.

El objetivo de los estudios de fase II es determinar si el fármaco candidato tiene efectos terapéuticos beneficiosos para los pacientes con la enfermedad en cuestión y si es seguro.

La investigación de la eficacia terapéutica se lleva a cabo en los llamados estudios de prueba de concepto, en los que el fármaco candidato se compara con un placebo o, si existe, con un tratamiento existente (normalmente el estándar de atención médica). Estos estudios suelen ser aleatorios y (doble)ciegos, pero no se excluyen los estudios abiertos.

Para probar la eficacia y maximizar el efecto, los estudios de prueba de concepto suelen utilizar la dosis máxima tolerada determinada en la fase I. Pero la fase II también investiga la dosis óptima y la frecuencia de administración del fármaco candidato y recoge información adicional sobre los efectos secundarios. Esto se hace en los estudios de dosis-respuesta. Los estudios de dosis-respuesta suelen ser aleatorizados y controlados con placebo, con grupos de estudio paralelos que estudian distintos niveles de dosis. El nivel de dosis cero es entonces placebo. También son posibles los estudios cruzados.

En total, la Fase II puede durar varios años. El candidato a fármaco puede pasar a la fase III si, basándose en los resultados de estos estudios de fase II, cumple unos criterios predefinidos. Estos resultados constituyen la base para el diseño de los ensayos clínicos de fase III.